Rapid RNAi vector construction by Gateway Technology - Kondo of Nara Inst. Sci. Tech.

影山先生のところから。Invitrogen Gateway Technologyを利用して遺伝子の強制発現用トランスジェニック作成ベクター pUAST への inverted repeat を含むクローニングを迅速に行うためのアイディアと実践。Ftz の intron を inverted repeat のリンカーに用いると RNAi の効率がいいらしい。考察はどうやら splicing 効率の高さではないかというもの。
高速化の原理は、制限酵素を用いないクローニング方法と ccdB という発現すると致死になる遺伝子カセットの利用。酵母の染色体組み換え酵素のターゲット配列を両端にもつようにクローニングできる kanamycin 耐性のベクターへ knock down したい目的の遺伝子断片を PCR で TOPO クローニング。pUAST には MCS ではなく、ccdB の遺伝子カセットとその両端に組み替え酵素のターゲット配列をもつ配列を Ftz イントロンの両側に用意。In vitro で組み換え反応を進行させる。
pUAST は amp 耐性なので、組み替え反応液をそのままトランスフォーメーションに使える。ccdB が両方とも目的遺伝子の inveted repeat で組み換えられていなければ transformant は致死。TOPO vector は kanamycin 耐性なので amp プレート上では増殖できない。最短４日でつくれるということ。