遺伝子設計

基本的なところでミスってることに気付く。でもなぜかクローニングに成功しているシークエンス結果。わけわからん。制限酵素ってけっこうアバウト？ Gene specific なプライマーに制限酵素サイトをフランキングさせるとき、 NEB の例のページを参照して数ベースつけるのは基本なんだが、改めてクローニング後にプライマーの配列を眺めると無かった...。よほどどうかしているときに設計したらしい。 NcoI は 5' 側に何もつけなくても切れる!
N末に遺伝子を融合させたが、first Met を入れ忘れてる気がする。当然ながら翻訳開始点がずれて下手すると fusion させた意味がない。しかし、配列情報が手元にないので明日だなぁ。
やはり Met 入れ忘れ。さらに Kozak も必要という。ストップコドン入れるだけのお気楽 C 末と N 末は話がだいぶ違うようだ。
Dominant negative および constitutive active な変異タンパク質のレシピはわかったんだけど、どうしてそうなるやら。なんとなく結晶解析系の論文を読まなければならない雰囲気。
論文乱読のせいか定石が頭にあるのでこんなことやってやろうっていうのはすぐに思いつくが、手が追いつかない。ジレンマだな。
Drosophila では immune response が起きないため siRNA を設計する必要がないので何も考えずに長鎖の dsRNA を transfection すれば割と安易に gene knock down ができるが、裏をとるための degerate version の rescue construst を作成するのが面倒。この辺のガイドラインを模索予定。